前面讲了pKa相关的基本概念和常见类型化合物的数据[从pKa到流动相pH的科学选择（一）：基本概念和pKa的确定或预测]以及缓冲液的基本知识[从pKa到流动相pH的科学选择（二）：缓冲液]，今天将介绍如何最终确定合适的流动相pH值，也就是本系列文章的收官篇。
流动相的pH是改变HPLC选择性的最有效的变量之一。在很多情况下，流动相的pH的改变会造成分析物的保留因子k的改变，另外也会对色谱峰展宽和拖尾产生重要影响。一般来说，pH的改变主要通过三个方面影响反相分离行为：溶剂化情况变化、固定相的改变或分析物的离子化状态改变。在这里，我们主要聚焦于流动相pH如何影响分析物离子化状态进而改变其疏水保留行为。
分析物疏水性的随着pH的变化情况与分析物分子上的可离子化基团的类型和数量有关，因此相对比较复杂，不能像优化其他因素（如有机相浓度、柱温）一样可以通过软件来优化。因此，当我们优化方法中pH的时候考虑化合物结构是非常明智的，这可以缩小pH的考察范围，让实验更精准高效。
前面提到有机相的加入会影响流动相的pH以及分析物的pKa，因此如果没考虑到这些因素会导致使用“±2规则”时出现老司机翻车的情况。举个例子：
阿米替林（Amitriptyline）在水中的pKa是9.4，缓冲液磷酸盐水溶液pH被调节到7.0，我们可以看到两者的差值为2.4个pH单位，因此可以预料到当把阿米替林溶解到这种缓冲环境中会完全被质子化而呈现离子态。但发现以磷酸盐水溶液(pH 7.0)/甲醇 = 35/65为流动相时，通过测试阿米替林的保留时间发现只有1/3的阿米替林被质子化，也就是说甲醇的加入让流动相pH和阿米替林的pKa都发生了漂移，而使阿米替林在这种情况下只有部分被质子化。
在这里，我们需要根据加入的有机相的类型和比例对pH的选择进行校正。对于乙腈，比例每改变10%，pH的校正因子为0.2个单位；对于甲醇，比例每改变10%，pH校正因子为0.1个单位。0-60%的范围内，校正因子还是比较准确的。
对于有机溶剂存在下流动相pH的校正只有简单的两步：1.分别计算有机溶剂加入对缓冲液pH和对可离子化分析物pKa的影响；2.对两者的影响进行加和。
存在有两种情况：
1. 假如缓冲液和分析物都是酸性或碱性，有机相的加入对pH和pKa的影响会很大程度抵消掉，总的校正因子约为0；此时，可以直接根据分析物的pKa来确定配置的缓冲液的pH。
2. 假如缓冲液和分析物的酸碱性不一致，即一个是酸性另一个是碱性，加入有机相时影响会非常大。有机相比例在0-60%的范围内，总的校正因子为对于乙腈，比例每改变10%，校正因子为0.4个单位，即对于酸性分析物pH校正因子为+0.4个单位，对于碱为-0.4个单位；对于甲醇，比例每改变10%，校正因子为0.2个单位，即对于酸性分析物pH校正因子为+0.2个单位，对于碱为-0.2个单位。
下图为有机相为乙腈时（甲醇的情况可以相应地计算出来），当分析物和缓冲液酸碱性不一致时的校正因子数据：
举个例子，假如选用的流动相中缓冲液为酸性，而分析的化合物为碱性时，如果从这种碱性化合物的pKa预测到pH 3-5是应该避免的区间，当我们的流动相条件中含有50%的乙腈时，校正因子为-2，因此可以预测到应该避免的区间为pH 1-3，这样可以获得稳定的保留时间。
缓冲液pH选择的系统方法
当分析一个给定的样品时，即使存在一个或者更多的化合物是未知的，选择合适pH的缓冲液是一个相对简单的过程。一般来说如果其中一个化合物什么官能团都不知道，它一般存在的量是很少的，因此峰形不是大问题。另外，未知化合物往往倾向于拥有和样品中其他化合物类似的官能团，因此用已知化合物的pKa值作为参考的起点是很合理的。
一个系统的选择缓冲液pH方法是：
1. 收集样品中化合物的所有结构信息；
2. 获得或者预测所有化合物的pKa值；如果只有部分结构已知，则考虑那些可离子化的官能团；
3. 根据“让每一种化合物保持为非离子化状态”这一原则在把pH划分为“可用/不可用”区间，这就要参考“±2规则”。当有冲突出现，优先考虑主要成分然后把可用的区域移动到其他化合物能够充分离子化的pH范围；
4. 在预测的pH条件下进行一个缓慢的梯度实验，评估分析物洗脱出来的溶剂强度并根据需要相应地调整pH；
5. 配制新的缓冲液，再次进样；
6. 如果有需要，可以在小范围内优化pH，以及/或优化其他参数。如果方法适用性对pH非常敏感，我们应该考虑把pH微调至一个更合理的pH范围；如果这不能实现，可能就需要非常小心地控制其他因素，包括柱参数和温度；
7. 当确定最终方法时，最好基于缓冲盐的质量而不是用pH计和用酸碱滴定来调节pH的方法来配置缓冲液，因为pH计的维护常常被忽略而导致测定值的不准确。
总结
到这里，“从pKa到流动相pH的科学选择”系列就都写完了，这篇主要阐述pH的校正问题。整个系列内容增删多次，前后历时一个多月，在此感谢多位同事和朋友给出的宝贵意见，也要特别感谢高昂博士，他提醒我每篇后面写个总结，让我思考如何优化文章的结构和内容分配。当时选择这个主题的初衷是让实验者对pH的选择多了一些方向和具体数据参考，但由于要兼顾内容阐述的清晰性和主题的专一性，总会或多或少地略去一些内容，如果想对这方面有更多的了解，可以去查阅文章的参考文献，也可以在文章后面留言或者直接微信和我沟通。
