前面比较系统地介绍了在RP-HPLC中添加IPRs的基本作用机理和几类重要的IPRs，这篇主要介绍对于添加了IPRs的RP-HPLC（即IPC）方法开发中选择性的控制和可能出现的问题及解决方法。

选择性的控制 

IPC中用于控制选择性的参数相对常规RP-HPLC更多，包括pH、IPRs的类型和浓度、溶剂强度、有机相类型、温度、色谱柱类型和缓冲溶液的类型和浓度等，而且其中一些变量对保留的影响是相关的。

1. 流动相的pH：在IPC中pH不仅影响分析物的离子化程度，也影响加入的IPRs的离子化进而影响与分析物的离子对作用，因此pH的改变对分析物保留的影响更加复杂。

2. IPRs的类型和浓度：大多数情况下，固定相中IPRs的浓度会影响溶质的IPC保留行为，而IPRs的类型和浓度会直接影响其在固定相中的浓度。前面在介绍传统的IPRs时提到烷基链长度和浓度对分析物的保留有着非常相似的影响，也就是当想要获得一定的保留时，可以使用更低浓度的疏水性更强的IPRs或者更高浓度的疏水性更弱的IPRs。当固定相中的IPRs达到饱和时，继续增加IPRs的浓度反而会降低分析物的保留，因为IPRs的反离子浓度增加，加大与分析物的离子交换竞争。

流动相的pH和IPRs的浓度的同时改变，则可以在很大程度上控制离子样品的保留范围和相对保留值。

3. 溶剂强度（%B）：我们知道在RP-HPLC中，%B的改变会使离子样品的绝对保留值和相对保留值都发生改变。对于IPC，%B的增加同时还会减少IPRs在色谱柱上的吸附，进一步减少与之配对的分析物的保留。

4. 溶剂类型：由于B溶剂会对IPRs在色谱柱上的吸附造成额外的影响，因此相对于常规RP-HPLC而言，IPC中改变溶剂类型会引起选择性更大的改变。

对于难以分离的离子样品，综合改变流动相的pH、IPRs的浓度和溶剂类型是非常有效的。

5. 温度：IPC中温度的改变会引起相对保留值发生显著性的变化。温度会改变色谱柱上吸附的IPC试剂的量，因此控制温度对分离特别重要。

6. 色谱柱类型和缓冲液：和常规的RP-HPLC不同的是，由于色谱柱固定相表面被IPRs部分覆盖，因此色谱柱的类型对IPC的分离影响相对没这么大，因此通过改变色谱柱的类型和达到控制IPC的选择性并不是首选的办法，也不会特别有效。而缓冲液的类型和浓度对于IPC分离非常重要，但是更可预见的选择性变化则可通过改变上述的其他因素来实现。

可能出现的问题和解决方法

1. 人工峰（artifactual peaks）：在IPC中，当进行空白实验（即注入样品溶剂）时，正峰和负峰有时候都可以观察到，这些异常的峰也被称为人工峰（artifactual peaks）。这些人工峰会干扰HPLC方法的建立或日常应用，因此在IPC方法建立之前和得到有希望的分离之后都应该进行空白实验。

人工峰问题通常是由流动相和样品溶剂之间的差异造成的，使用的缓冲剂纯度不够、离子对试剂或者其他流动相添加剂都会放大这种影响。

解决方法：

a. 让样品溶剂尽量接近流动相的组成，比如直接用方法的初始流动相溶解样品；

b. 增加进样浓度、减少进样体积（如<50 μl）;

c. 使用不同批次和厂家的离子对试剂来对比。

2. 缓慢的色谱柱平衡：相对于不添加离子对试剂的RPC，IPC由于涉及到多种复杂的平衡过程，因此一般来说RPC的色谱柱平衡时间相对较长。因此，当一种或者两种流动相中都含有离子对试剂时，改变流动相后必须证实样品保留值能够重现，才可开始使用。当使用的离子对试剂疏水性较强（例如庚烷磺酸盐与己烷磺酸盐）或季铵盐试剂（如四丁基铵）时，柱平衡通常较慢。

由于平衡较慢，当使用IPC时选择梯度洗脱方法可能会导致一系列的问题，比如保留值重现性较差、基线不稳及其它一些分离问题，因此通常不推荐IPC中使用梯度方法。但对于使用小分子离子对试剂如三氟乙酸（TFA）和三乙胺（TEA）时，其柱平衡较快，使用梯度洗脱一般也没问题。

当我们发现目前选择的离子对试剂不合适而想换一种离子对试剂时，如果不更换色谱柱，最好先充分清洗原来色谱柱中的离子对试剂，再用新流动相平衡色谱柱。不同的离子对试剂有不同的清洗方法：

对于阴离子试剂（如磺酸盐）：用50-80%的甲醇-水清洗；

对于季铵盐类试剂：用50%甲醇-缓冲剂（100-200 mM）(如pH 4-5，100 mM磷酸钾)清洗，其中加入磷酸钾的目的是降低试剂铵基与硅羟基发生作用。

在用新流动相检查保留值重现性之前，至少应使用20倍柱体积的清洗溶剂进行清洗。

3. 峰形问题：一般来说，加入离子对试剂会改善由于硅胶基质色谱柱上残留硅醇基团带来的峰形问题。如果在IPC中出现峰形问题，如峰前延等，改变温度可能是有效的解决方式。因此当遇到峰形不好和/或塔板数降低时，最好研究一下温度变化对峰形的影响。

总结：本篇简单介绍IPC方法开发或优化中各参数对选择性的影响，以及可能出现的问题及应对方法，为本系列文章画上句号。当我在为这个主题筛选参考资料时，发现Teresa Cecchi已经为这个主题写了一本专著（见参考文献1），既高兴又感到压力山大，因为明白想通过三个短篇来写全这个主题是不可能的，因此需要对材料进行不断删减，这个过程非常痛苦纠结。IPC到目前为止仍是分析离子型大极性化合物的重要方法，但相对常规RP-HPLC更复杂，重现性和稳定性也存在劣势，随着研究者对新型的色谱柱固定相（如带有电荷或者极性基团的固定相，后面有机会可以系统介绍）不断开发和商品化，可以预见IPC的地位将逐渐弱化，这对色谱分析工作者来说也是一件好事。

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