一、标本制作要求

1）载玻片

载玻片厚度应在0.8~1.2mm之间，太厚的坡片， 一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。

2）盖玻片

盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光 ，也可用于涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起到不同干涉作用的物质(如氟化镁)的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光可激发标本。

3）标本

组织切片或其他标本不能太厚，若太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重叠或杂质掩盖，影响判断。

4）封裱剂

封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5~9.5时较亮，不易很快褪去 。所以，常用甘油和0.5mol/L pH值为九到九点五的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。

5）镜油

一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。

二、荧光染料的使用

1）吖啶橙

吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光，DNA显绿色荧光，RNA显橙红色荧光。

2）溴化乙锭

染色DNA和RNA。

3）荧光素双醋酸酯（FNA）

荧光素双醋酸酯本身无荧光，无极性，可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后，由于受到酯酶分解而产生具有荧光极性物质荧光素。

4）荧光染料Ho33342和罗丹明123

荧光染料Ho33342能与细胞中DNA进行特异性结合，罗丹明123能与线粒体进行特异的结合。

注意：

①每种荧光染料，均有自己的最适pH值，此时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的pH值的缓冲液中进行。

②荧光染料在20摄氏度以下荧光比较稳定，温度升高常出现猝灭。

③在荧光观察中，常因激发光的增强而使样品荧光很快衰竭，造成观察和照相困难。为此最好能用能量小的长波长光进行观察，需照相时再适当增强激发光。

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