本系列文章（一）谈到了在RP-HPLC中添加离子对试剂（IPRs）的基本作用机理，接下来将在这个基础上具体了解一下几类重要的离子对试剂。

根据IPRs的历史地位和物理化学性质等，可以将其分为以下几大类：

一、传统的IPRs

也就是最早被使用、到现在也是最常见的一类IPRs。根据离子形式，传统IPRs也包含两大类，一类是阳离子型IPRs，常见的是带有不同链长烷基的有机胺或者铵盐，比如三乙胺，四丁基溴化铵等，加入流动相中可以增强阴离子型分析物的保留；另一类是阴离子型IPRs，常见的是烷基或者芳基磺酸盐，比如十二烷基磺酸钠，辛烷磺酸钠等，加入流动相中可以增强阳离子型分析物的保留。

这些传统的IPRs的烷基链长度和浓度对分析物的保留有着非常相似的影响，也就是当要获得一定的保留时，可以使用更低浓度的疏水性更强的IPRs或者更高浓度的疏水性更弱的IPRs。一般来说，它们的使用浓度的范围是0.1 mM到100 mM。如果使用的IPRs疏水性非常强，那么它会在固定相上产生持久的保留，就算不继续添加这种IPRs，也仍然会增加带有相反电荷的分析物的保留。这对于实际工作来说就是一把双刃剑，一方面这可以在一次使用后可以减少甚至不用添加这类IPRs，更加经济环保，但是需要定期检查保留时间的稳定性；另一方面，由于已经对色谱柱产生了不可逆的的改性，因此强烈建议专柱专用，特别在开发新方法的时候，一定要注意不要使用这种被改性过的柱子，不然可能在使用新柱子时不能重现原来的结果。

二、挥发性IPRs

现在越来越多的分析实验室配置LC-MS，但传统的IPRs由于其非挥发性而与MS不兼容。另外，这些为了增强分析物保留而加入的IPRs可能会对分析物的离子化产生严重的影响。因此，必须使用兼容MS的IPRs来实现IPC-MS联用。

小分子有机酸（如甲酸，乙酸等）是有效的挥发性IPRs。这些IPRs可以影响对pH敏感的化合物的保留行为，改变它们的电性并能提供阴离子与质子化的分析物作用。同时，这些有机酸能够抑制色谱柱硅胶基质残留的硅醇基团的活性，对峰形有利；另外这些酸性IPRs也有利于质子化的分子离子[M+H]⁺的形成，方便在常见的正离子模式下的质谱检测。

另外在多肽、氨基酸、亲水代谢物和离子性碱的分析中，全氟羧酸类（如三氟乙酸，五氟丙酸，七氟丁酸）越来越多地被应用。这类IPRs也可以抑制硅醇活性、改善峰形。其中三氟乙酸（TFA）由于其优秀的水溶性和低的截止波长（210 nm）而备受重视；七氟丁酸（HFBA）由于有区别于三氟乙酸（TFA）、五氟丙酸（PFPA）的选择性，也被用于与MS联用，但是它会在一定程度上污染质谱。当使用蒸发光散射检测器（ELSD）或者使用制备HPLC时，挥发性的全氟羧酸类的IPRs也有用武之地。

当分析物对酸不稳定或者在低的pH条件下没有最佳的的分离时，可能需要更中性的条件，这时需要挥发性盐比如甲酸铵，乙酸铵等，这些盐的pH同时兼容正离子和负离子模式的检测，不过此时最关心是这些盐在有机溶剂（特别是乙腈）的溶解性问题了。基于这些考虑，挥发性的烷基、二烷基和三烷基胺的甲酸或者乙酸盐在保留、选择性以及质谱响应方面取得了折衷的效果；另外，四丁基乙酸铵和四丁基溴化铵也有满足IPC-ESI-MS的足够的挥发性。

三、离液盐（Chaotropic Salts）

离液盐是一种可以扰乱水分子间的氢键、增加其混乱度的盐，比如在离子对色谱中常见的高氯酸盐、六氟磷酸盐等就属于离液盐。合适的离液盐的加入可以增强离子型分析物的疏水性，从而提高其保留。根据离液盐的电荷离域性和极化率大小，在Hofmeister系列中被排序，电荷离域性越强、极化率越大，离液序列越高，也就是扰乱水分子间氢键的能力越强。对于常见的阴、阳离子的离液性能排序如下：

PO₄^3-< SO₄^2- < H₂PO₄^-< HCOO^- < CH₃SO₃^- < Cl^- < NO₃^- < CF₃COO^- < BF₄^-< ClO₄^- < PF₆^-

Ca²⁺< Mg²⁺ < Li⁺ < Na⁺ < K⁺ < NH₄⁺

离液盐在RP-HPLC中非常重要的应用是增强碱性化合物的保留。据估计，现在大约有80%的药物分子中含有碱性官能团，但是由于其在RP-HPLC上的保留随流动相pH的变化太极端，且容易与硅胶基质色谱柱中残留硅醇作用而拖尾，因此这些化合物的RP-HPLC分析一直存在挑战性，而阴离子型离液盐在增强在RP-HPLC中低pH条件下碱性化合物的保留方面有独特的作用。其中的作用机制是离液盐阴离子与质子化的碱性分析物产生强的离子对作用而对它们之间的水分子产生排斥，从而形成一个中性的复合物，这种复合物在疏水的固定相上有更好的保留；当然也有研究者认为分析物保留的增强也与离液盐离子在反相固定相上的吸附有关。

除了现在流行的阴离子型离液盐IPRs，也有对可极化阴离子有独特选择性的阳离子型离液盐，这里就不再展开。离液盐对分析物的保留产生与传统IPRs类似的效果，但其中的机理却有所不同；与传统的IPRs类似，不同类型的离液盐会对分离的选择性、效率和重复性有不同的影响，但与传统的IPRs倾向于强烈吸附在固定相上并会对色谱柱性能产生不可逆的改性不一样的是离液盐由于亲水性强，当使用后容易被清洗出色谱柱而不产生明显残留。

四、离子液体型IPRs

离子液体（Ion Liquids，ILs）是具有低熔点（往往低于100 ℃）的熔融盐，它们具有优秀的热稳定性、化学稳定性、低蒸气压、低可燃性、好的电导率等。应用于分离科学中离子液体主要是室温下为液体的离子液体（RTILs），它们被研究用来作为萃取溶剂、固定相和流动相以及流动相添加剂等。常见的RTILs包含一个大体积的含氮或含磷有机阳离子（如吡啶或吡咯烷鎓、烷基咪唑离子、铵或膦离子）和有机或者无机阴离子（如三氟甲磺酸离子、三氟乙酸离子、乙酸三氟甲基硫酸离子、硝酸根离子、高氯酸离子、溴离子、氯离子、氯铝酸离子、四氟硼酸离子、六氟磷酸离子等）。

在液相色谱和电泳方法中，离子液体的主要应用形式是作为添加剂溶解在水溶液中。如果一种离子液体在溶液中的浓度低至mM级别，它可能作为流动相中的离子对试剂。它们在RP-HPLC中可以抑制可能存在的硅醇的活性，提供比烷基胺更好的硅醇屏蔽作用，因此有利于碱性化合物的获得好的峰形和分离效果；同时由于其与固定相的疏水作用以及与带电分析物的离子成对作用，它们也被视为独特的IPRs，通过改变它们的类型和浓度，可以对分离结果进行有效的调控。

通过对机理中五大平衡的理解，可以对改变后的结果进行比较准确的预测。比如在RP-HPLC中分析物为某一碱性化合物时，把原来体系中的NaCl换成同样浓度的1-丁基-3-甲基咪唑氯化物这种离子液体，发现保留因子减小30%，同时峰形有了显著的改善。这是因为离子液体中的阳离子比Na⁺更多地吸附在固定相上，增加了和带正电荷的分析物的电荷排斥作用，从而使保留变弱，峰形变好。

值得注意的是，离子液体由于它们的非挥发性而不兼容IPC-MS体系，同时其轻微的紫外吸收也会限制它们在UV检测器条件下的使用。

总结：本篇主要介绍几大类离子对试剂，每一类离子对试剂从具体组成到作用机制都会有一定的差别。从广义上说，其实任何带电物质加入到流动相中都可以充当离子对的作用：它们和固定相发生作用，从而改变固定相与分析物的作用；同时也与带电分析物发生电荷成对作用，最终改变分析物的保留。下一篇将介绍IPC中选择性的控制和可能出现的问题及解决方案。

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